类阮蛋白结构域对BAF复合物的肿瘤特异性重定位
Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain
本文的Highlights
1.EWS-FLI1结合并招募BAF复合物到GGAA微卫星序列
2.GGAA重复序列处的从头增强子激活时EWS-FLI1的一个新的性质
3.ES-FLI1的PrLD对于相的转换和增强子的从头激活是必要的
4.小的PrLD片段与FLI1的融合足够激活 EWS-FLI1的活性
转录因子的改变可以在癌症中协调致癌基因的表达程序，在本文中，作者研究发现BRG1/BRM相关因子染色质重塑复合体，在超过20%的人类肿瘤中发生突变，他们与EWSR1相互作用，EWSR1 是一个具有阮病毒样结构域的PrLD的蛋白质家族成员，是与转录因子癌基因融合的常见的伙伴。在尤文氏肉瘤中，我们发现BAF复合物能够被EWSR-FLI1融合蛋白招募到肿瘤特异的增强子上，从而帮助靶基因的激活，与野生型的FLI1相比，这是融合的FLI1的新的性质并且这一性质，依赖于EWSR1类阮病毒结构域相变所必须的酪氨酸。此外，EWSR1到FLI1的短片段融合足以重述BAF复合物重定位和EWS-FLI1活性。因此，我们的研究表明，朊病毒样结构域的物理性质可以重新定位关键的染色质调控复合物，以建立和维持致癌基因表达程序。
SWI/SNF或者BAF/BRG1/BRM相关的因子复合物时ATP依赖的染色质重塑因子，有12-15个亚基组成，它们可以调整基因组的结构和DNA的可接近性。近期的外显子测序研究表明，在将近20%的人类肿瘤中编码BAF相关的基因都存在突变。有趣的时在不同亚型的癌症中，如变得亚基有不同，这表明了这些亚基具有组织特异性的功能。BAF复合物亚基在多种肿瘤中的高频率突变，表明它们在控制染色质的结构和及以表达中起关键作用。
利用无偏质谱法，我们现在发现BAF复合物在几种细胞类型中与野生型蛋白EWSR1相互作用，在尤文肉瘤中与EWS-FLI1融合蛋白相互作用。BAF复合物被EWS-FLI1特异性地募集到肿瘤特异性GGAA重复微卫星上，是激活靶基因的必要条件。值得注意的是，在这些重复位点重新招募BAF复合物和激活增强子的能力是EWS-FLI1的一个新形态特性，它依赖于EWSR1类朊病毒结构域中的酪氨酸残基，这是其与野生型EWSR1相互作用和体外相转移特性所必需的。这些观察结果扩展了BAF复合物错靶导致肿瘤发生的人类癌症的范围，超出了BAF复合物基因本身发生突变的范围，并表明通过朊病毒样结构域的募集是将关键染色质调节复合物重新定位到肿瘤特异性位点的有力手段。
结果
1.BAF复合物与野生型EWSR1和融合蛋白EWSR-FLI1相互作用
2.EWS-FLI1招募BAF复合物到肿瘤特异的GGAA微卫星位点重复增强子激活靶基因的表达
3.与野生型FLI1相比，将BAF复合物招募到GGAA重复序列是EWS-FLI1融合蛋白的一个新特性
4.EWSR1和FLI1的融合促进了prion-like相转换的性质
相转换被定义为生物体系相状态的改变，包括从蛋白质溶液向液滴样相分离区室的形成即形成无膜细胞器。EWSR1属于FUS。EWSR1TAF15家族的蛋白质，这类蛋白质的公认
特点是都具有内在的固有紊乱的低复杂度的PLD结构域，而这些结构的存在，赋予了多种聚合，物理的液液相分离，以及病理条件下的蛋白质的聚集。作者通过在U2OS细胞里表达GFP标记的EWSR1，并进行GFP免疫沉淀，发现融合蛋白EWS-FLI1和EWSR1表现出强的互作。
5.EWS-FLI1类朊病毒结构域中的酪氨酸残基是GGAA微卫星DNA结合和从头增强激活所必需的
6.将EWSR1类朊病毒结构域片段融合到FLI1C末端足以重新概括EWS-FLI1的活性
讨论
总之，我们的研究阐明了EWSR1参与EWSFLI1致癌活性的关键机制（图7）。低复杂度域被认为在正常细胞功能和疾病状态中发挥多种作用（Aguzzi和Altmeyer，2016；March等人，2016）。在正常细胞中，含有固有无序结构域的蛋白质被认为有能力形成液体样的腔室，在FUS蛋白质的情况下，这种腔室在受到应力时在细胞质和细胞核DNA损伤部位的活体内观察到（Patel等人，2015）。如肌萎缩侧索硬化症（ALS）所观察到的那样，这一过程可以通过朊病毒样结构域或局部蛋白质聚集的突变而改变，在ALS中，低复杂度蛋白质的病理聚集可能是从液态到固态转变的结果
我们的结果表明，类似的相变机制可以在尤因肉瘤的肿瘤特异性DNA结合位点以及其他涉及FET家族蛋白与转录因子融合的肿瘤类型中实现蛋白质的积累和稳定。进一步的表征将是必要的，以查明这些转变在染色质的确切性质。事实上，确定EWS-FLI1在体内是否形成纤维或无定形聚集体或经历液-液相分离，以及从治疗的角度可以在多大程度上利用这些新形态特性的破坏，将是非常有意义的。
编码BAF复合物亚单位的基因在许多肿瘤类型中都有突变，表明BAF复合物组成和功能的肿瘤特异性变化在人类癌症中的重要作用（Kadoch等人，2013）。我们现在证明，在BAF复合物成分没有遗传改变的情况下，EWS-FLI1融合蛋白利用一种替代机制将BAF复合物重新定位到远端调控元件。这反过来又导致靶基因的激活和肿瘤特异性调控网络和转录程序的建立。肿瘤特异性靶向fbaf复合物可能因此在许多BAF亚单位没有基因改变的肿瘤类型中发挥重要作用，从而扩大了这些复合物在人类癌症中已经广泛的作用。鉴于我们先前的结果表明，EWS-FLI1还介导乙酰转移酶P300和混合系白血病（MLL）复合物向GGAA重复序列的募集（Riggi等人，2014年），确定这些染色质修饰复合物之间的相互作用如何导致从头增强剂激活将是重要的。
BAF亚单位的改变也可能与BAF复合物的亚单位组成和结构的改变有关。滑膜肉瘤已经证实了这一点，在滑膜肉瘤中，SS18-SSX易位导致BAF复合物的改良版本的形成，其中包含易位蛋白（Kadoch and Crabtree，2013）。我们的结果表明，尽管EWS-FLI1与BAF有很强的相互作用，但它并不包含在核心BAF复合体中，因此不会直接影响BAF的组成。然而，与EWSR1类朊病毒基序诱导的潜在相变相关的BAF复合物向GGAA重复的招募可能涉及一种不寻常的结构，可用于开发新的治疗方法。
总之，我们的研究表明，朊病毒样结构域可以赋予融合蛋白新的特性，从而导致关键染色质调节因子的重新定位和致癌基因调控程序的建立。由FET家族蛋白或其它内在无序蛋白介导的类似事件可能在多种肿瘤类型中产生肿瘤特异性调节元件方面发挥重要作用，并可能成为治疗发展的有吸引力的靶点。
全文的一个工作机制图
