ELISPOT酵素結合免疫スポット技術マニュアル

ELISPOT酵素結合免疫スポット技術

Enzyme Linked Immunospot Assay（ELISPOT）は、細胞免疫学研究においてより感度の高い検出方法であり、抗体分泌細胞（ASC）およびサイトカイン（CK）分泌細胞を単一細胞レベルで検出できます。ELISAおよび限界希釈法は感度が高く、200,000〜300,000個の細胞からタンパク質を分泌する1つの細胞のみを検出できます。また、抗原刺激を受けた生細胞の機能検出が可能で、特異性が比較的高く、直感的な信頼性があり、操作が簡単です。分泌型CK細胞の検出やASC検出などに広く利用され、広く利用されています。免疫学コミュニティは広く使用されています。

 

ELISPOT実験手順

リンパ球は抗原によって刺激されてサイトカインを局所的に産生します。サイトカインは、ELISPOTプレートの下部にあるPVDFメンブレン上の特定のモノクローナル抗体（プレコート）によって捕捉されます。細胞を除去した後、捕捉されたサイトカインはビオチン標識モノクローナル抗体と結合し、次にアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたアビジンと結合します。基質を発色のために添加すると、PVDFメンブレンに紫または赤褐色のスポットが現れ、細胞がサイトカインを産生したことを示します。スポットは自動的にカウントされ、ELISPOTリーダーによって分析されます。

 

 

02ドイツAID酵素結合免疫スポット分析装置

ドイツの会社AIDは、長年にわたって免疫スポット分析装置の研究開発に注力してきました。1990年代以降、AIDは、周辺の科学研究、臨床、および製薬研究所向けに多数の酵素結合免疫スポット分析装置（AID ELISPOTリーダー）を提供してきました。世界。）、文学のさまざまな分野でのそのアプリケーションはどこでも見ることができ、世界中の科学研究者によって認識されているブランドになっています。

AID酵素免疫測定法は、ELISPOTプレートの各穴のスポット画像を自動的に収集、カウント、分析するために使用されます。スポット数を自動的に取得してサイトカイン分泌活性値を与えるだけでなく、事前設定された解釈ルールに基づいて、ネガティブおよびポジティブな結果を直接取得し、その結果をJPG、EXCEL、TXT、PPTなどに出力します。また、データ管理と出力のためにラボのLMSシステムに接続して、信頼できるELISPOT分析にすることもできます。ツール。


さらに、従来のELISPOTにも制限があり、T細胞によって産生される複数のサイトカインを同時に検出することはできません。この問題を克服するために、蛍光標識に基づいた蛍光免疫スポット分析法（FluoroSpot）が開発されました。この新しい蛍光免疫スポット分析技術は、IFN-γ（緑色蛍光マーカー）およびIL-2（赤色蛍光マーカー）と共発現するT細胞など、単一細胞レベルで複数のサイトカインを発現するリンパ球を検出できます。

ドイツのAIDiSpot Readerは、酵素結合免疫スポットアナライザーを使用して、従来のELISPOTと蛍光免疫スポットの両方の蛍光スポット分析を実行することを初めて実現しました。AIDiSpotReaderは、緑色蛍光スポット（FITCラベルIFN-γ）と赤色蛍光を測定します。スポット（Cy3でラベル付けされたIL-2）はそれぞれ画像を収集し、2つの画像はFluoroAID特許取得済みの蛍光画像オーバーレイテクノロジーによって融合され、共染色されたスポットカウントの精度を保証します。

 

ELISPOTキットタイプ

AID酵素結合免疫スポット分析装置は、世界的に有名なELISPOT試薬メーカーであるSwedish Mabtechの製品を採用しており、ヒト、サル、マウス、ラット細胞、その他の種、および獣医学分野で牛を検出するために使用できます。 、羊、馬、豚。サンプルのT / B細胞免疫応答。IFN-γおよびインターロイキンシリーズに加えて、検出可能なサイトカインには、TNF-α、パーフォリン、グランザイムB、およびMIP-1βも含まれます。

01

人

apoE、GM-CSF、グランザイムB、IFN-α（subt.2、8、10、14、17）、IFN-α（パン特異的）、IFN-γ、IL-1β、IL-2、4、5、 6、10、IL-12 / -23（p40）IL-12（p70）、13、17A、21、23、31、MIP-1β、パーフォリン、TNF-α;

02

モンキー

 IFN-γ、IL-2、IL-17;

03

マウス

GM-CSF、IFN-α、IL-4、5、6、IL-12 / -23（p40）、IL-13、IL-21、MIP-1β、パーフォリン、TNF-α。IFN-γ、IL-2、IL-17A;

04

その他

 

ライムスポット、EBVスポット、CMVスポット、トランススポットキット;

その他のT細胞/ B細胞ELISPOTおよびFluoroSpotキットについては、お問い合わせください。

 

ELISPOTを選ぶ理由

 

• 高感度：200,000〜300,000の1つの陽性細胞の検出率。

• 直感的で信頼性の高い：単一細胞レベルの検出、1つの陽性細胞には1つのスポットがあり、スポットの数はサイトカインを分泌する細胞の数を表し、スポットのサイズは細胞によって分泌されるサイトカインのレベルを表します。

• ハイスループット：1枚のELISPOTプレートを96回のテストに使用でき、科学研究者は1日あたり数百のサンプルをテストできます。600種類の抗原/ペプチドの反応をテストするには、45mLの血液などの少量の細胞で十分です。

• 生細胞機能テスト：検出されたサイトカインはまだ存在していませんが、テストプロセス中に追加された刺激の刺激によって分泌されます。

• 臨床試験への適用：凍結保存と蘇生を受けた細胞は免疫機能を失うことはありません。これは臨床試験にとって非常に重要です。治療前後のサンプルを並行してテストし、結果を繰り返すことができます。臨床機関では、血液サンプルを凍結することができます。テストのためにコアラボに輸送します。

 

ELISPOTはフィールドで正常に適用されました

01感染症の診断と研究

ELISPOTは、科学研究ツールであるだけでなく、臨床診断にも使用されます。最近、SFDAによって承認された最初のELISPOTベースの診断プラットフォーム（T-Spot.TB）が発売されました。結核感染を検出するためのこの試験方法は、結核特異的抗原刺激後のIFN-γの分泌を測定することによって特定のT細胞免疫応答を検出することです。感度と特異性を大幅に改善しながら、従来の皮膚検査に取って代わることができ、BCGワクチン接種の影響を受けません。ELISPOTは、B型肝炎、C型肝炎、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ライム病などの他の感染症の研究と診断にも使用できます。

02ワクチン研究

ELISPOT法は、ワクチンの細胞性免疫のレベルを検出および評価するための国際的に認められた標準ツールです。IFN-γELISPOT法は、HIVワクチン研究における免疫応答を監視するために国際的に広く使用されており、ELISPOT法は、国際AIDSワクチン行動計画における新しいHIV候補ワクチンの多数の試験でT細胞機能を評価するために使用されています。ELISPOT法は、強力なT細胞応答を誘導するワクチンの能力を測定することによってワクチンの有効性を定義します。ワクチンの開発および設計中に、ELISPOT法を使用して、抗原の特定のT細胞エピトープをスクリーニングおよび決定できます。この情報を使用して、適切な免疫戦略および免疫経路を評価することもできます。

中国医薬品生物製剤検査院の「予防のためのDNAワクチンの前臨床研究のための指導原則」および「ウイルスを担体として使用する生ワクチン調製物の予防のための技術的指標の原則」はすべて、ELISPOT法が検出およびワクチンの細胞性免疫を評価する効果的な効力の方法。ELISPOT技術は、T / B細胞特異的分泌をより高感度に検出する方法として、少数の抗原特異的メモリーT細胞を検出するためにも特に重要であり、予防ワクチンやAIDSワクチンなどの治療ワクチンに広く使用されています。 B細胞炎。ワクチン、インフルエンザワクチンおよびさまざまな腫瘍ワクチンの開発と評価。

03免疫学の基礎研究

テストされたさまざまなサイトカインによると、ELISPOTは、活性化されたT細胞のさまざまなサブグループを区別するために使用できます。たとえば、Th1細胞は主にIFN-γ、IL-2、TNF-αを分泌しますが、IL-4、IL-5、IL-13などの他のサイトカインは一般にTh2細胞から分泌されます。Th2反応はアレルギーの主な反応であるため、アレルギー研究のホットスポットの1つは、ELISPOTを使用してTh2サイ​​トカインを測定することですが、通常は低頻度で発生し、高感度の方法で検出する必要があります。

04アレルギー研究

アトピー性アレルギーの免疫療法では、T細胞の免疫反応が監視されます。細胞性接触アレルギーのin vitroでの検出と診断の適用において、ELISPOT法はアレルギー労働者からますます注目を集めています。フローサイトメトリーやELISAなどの他の方法では常に検出が難しいTh2型反応の主なサイトカインであるIL-4などの因子については、アレルゲン特異的免疫を研究するために高感度ELISPOT法の適用が特に重要です。反応。

05自己免疫疾患研究

ELISPOTの技術は、I型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の診断と原因の研究にも広く使用されており、疾患の原因分析、疾患予測、早期診断、治療ガイダンス、予後分析を待っています。

ELISPOTは主にT細胞とB細胞の分析に使用されますが、単一細胞レベルでタンパク質分泌を研究したい実験にも適しています。この方法は、LPSがPBMCを刺激した後にIL-6およびIL-1βを分泌する単球の定量分析など、エフェクター細胞の数が重要または生物学的に重要な実験に特に適しています。さらに、分泌細胞では特に形質細胞様樹状細胞など、血中の数が非常に少ない非常に少数の研究に適していますが、ELISPOTを使用すると、活性化後に分泌されるIFN-αを簡単に検出できます。

たとえば、
薬物スクリーニング：化合物と薬物免疫反応のスクリーニング;
腫瘍免疫研究：癌患者の腫瘍特異的T細胞を分析および評価するために使用されてきたワクチン試験。治療前後の特定の細胞性免疫応答レベルの検出は、治療の効果を効果的に評価し、治療と投薬のための重要な参照情報を提供することができます。
移植免疫研究：移植における拒絶反応の予測。

 

AID酵素結合免疫スポットアナライザーモデル

01

AID ELISPOTリーダークラシック（基本）

発売以来、世界中の1,500を超える研究所がAIDのELISAを使用しています。AIDELISPOTReaderのハードウェアとソフトウェアは、EU CE認定、FDA 21CFR part11仕様、およびGMP / GLP標準に完全に準拠しています。

スポット画像の収集とカウント
自動プレート読み取り、各穴の画像の自動収集、スポット数の自動計算、およびサイズ、面積、光学密度などのスポット関連情報。さまざまな要素の組み込みパラメーター設定を直接呼び出すことができます。CountAID関数は、読み取りパラメーターの最適化を支援し、インテリジェントなパラメーターメモリ関数を備えています。
結果分析
は、陰性および陽性の検査結果を直接判断します。診断モジュールAIDiagnosticは、臨床診断のためのELISPOT実験の結果の解釈に適しており、各患者のスポット画像と結果レポートを個別に出力します。スポット分布を統計的に分析します。各穴の免疫反応の強さを比較し、サイトカイン分泌の定量的比較など。
データ出力と品質管理
により、シングルウェル画像、任意のウェル、プレート全体の画像を出力できます。複数の保存形式、Excel、Txt、PPTなど。出力データは、スポット番号、SFU、光学密度強度、アクティビティ、スポットなどをカスタマイズできます。分布図等; GLP仕様に沿った品質管理モジュール、操作履歴の自動記録を含む。

01

AID iSpot Reader蛍光酵素結合免疫スポットアナライザー（可視光/蛍光）

 

蛍光デュアルカラーELISPOT分析-FluoroSポットは、特許取得済みの蛍光画像オーバーレイテクノロジーを使用して、多色因子共分泌スポットの正確な識別を保証し、酵素標識デュアルカラー検出におけるさまざまなサイトカインの不均一な分泌によって引き起こされる誤判断を回避します。4〜8ポジションのフィルターホイール、自動切り替え、少なくとも標準のFITCおよびCy3蛍光フィルター、他の波長を追加できます。


完全自動解釈
iSpotは、FITC標識IFN-γおよびCy3標識IL-2の分泌の検出など、プレート上の各ウェルのさまざまな色の蛍光スポットを画像化し、ソフトウェアはさまざまな蛍光画像をオーバーレイします（オーバーレイ）、共分泌（IFN-γ＆IL-2）細胞を正確に特定します。プロセス全体は、手動の介入なしで完全に自動化されています。

安定したパフォーマンス、優れた互換性、スケーラビリティ

高エネルギー励起により弱い蛍光シグナル検出が保証され、狭帯域フィルターにより特定のシグナル検出が保証され、マルチカラー拡張には追加のフィルターのみが必要です。

技術の進歩

酵素結合スペックルアナライザーを世界で初めて販売し、1996年に「ELISPOT法を用いた血球活性検出」の特許を発明しました。これは「蛍光フィルターに基づく蛍光多色ELISPOT検出システム」の唯一の特許です。 "は特許PCT / EP2008 / 009112-FluoroAIDでした。

学術出版機関

2007年の蛍光モデルの発売から現在まで、蛍光ELISPOTアプリケーションのSCI文献の80％がAIDによって公開されており、これは蛍光検出のより良い選択肢として認識されています。

高い国際的認知

オックスフォード大学のオックスフォード免疫学研究所と緊密に協力して開発されたのは、結核酵素結合スポット（T-Spot）診断のための特別なツール、国際AIDSワクチンアクション（IAVI）指定ブランド、世界的に有名なELISPOTキット開発研究所（スウェーデンなど）です。 Mabtech）専用ブランド。WeChatで「ZepingTechnology」を検索して相談してください！