在二代测序合成的过程中随着合成链的增长，DNA聚合酶的效率会不断下降，特异性也开始变差，这就会带来一个问题——越到后面碱基合成的错误率就会越高，以下几个指标用于观察数据的质量情况
read各个位置的碱基质量值分布 ：大于30且波动较小
碱基的总体质量值分布：大部分高于20
read各个位置上碱基分布比例，目的是为了分析碱基的分离程度，AT CG在1%以内
GC含量分布
read各位置的N含量，一般不该出现
read是否还包含测序的接头序列：
当测序read的长度大于被测序的DNA片段【注】时，就会在read的末尾测到这些接头序列（如下图）。一般的WGS测序是不会测到这些接头序列的，因为构建WGS测序的文库序列（插入片段）都比较长，约几百bp，而read的测序长度都在100bp-150bp这个范围。不过在进行一些RNA测序的时候，由于它们的序列本来就比较短很多只有几十bp长（特别是miRNA），那么就很容易会出现read测通的现象，这个时候就会在read的末尾测到这些接头序列。
read重复率，这个是实验的扩增过程所引入的
rimmomatic的好处在于，它不但可以用来切除illumina测序平台的接头序列，还可以去除由我们自己指定的特定接头序列，而且同时也能够过滤read末尾的低质量序列，多线程运行，数据快，适合RNA-seq数据的预处理，由于数据结果中reads长度不一，剔除的数据量要多一些，不适用于denovo组装的short reads.
rimmomatic 使用参数
- ILLUMINACLIP，接头序列切除参数。LLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10（省掉了路径）意思分别是：TruSeq3-PE.fa是接头序列，2是比对时接头序列时所允许的最大错误数；30指的是要求PE的两条read同时和PE的adapter序列比对，匹配度加起来超30%，那么就认为这对PE的read含有adapter，并在对应的位置需要进行切除【注】。10和前面的30不同，它指的是，我就什么也不管，反正只要这条read的某部分和adpater序列有超过10%的匹配率，那么就代表含有adapter了，需要进行去除；
【注】测序的时候往往只会在测到一些部分的adapter，因此read和adaper的时候肯定是不需要要求百分百匹配率的，上述30%和10%其实是比较推荐的值。
SLIDINGWINDOW，滑动窗口长度的参数，SLIDINGWINDOW:5:20代表窗口长度为5，窗口中的平均质量值至少为20，否则会开始切除；
LEADING，规定read开头的碱基是否要被切除的质量阈值；
TRAILING，规定read末尾的碱基是否要被切除的质量阈值；
MINLEN，规定read被切除后至少需要保留的长度，如果低于该长度，会被丢掉。
FastUniq 去除illumine paried reads中的PCR重复。对de novo组装或序列覆盖度的分析很有意义。
使用：fastuniq -i input.list -o reads1.rd.fastq -p reads2.rd.fastq
接下来是sickle：
$ sickle se -f raw_data/untreated.fq -t sanger -o u.sickle.fq
SE input file: raw_data/untreated.fq
Total FastQ records: 250000FastQ records kept: 249742FastQ records discarded: 258这里的fastq输入文件通过 -f 参数传入，输出结果通过 -o 参数指定。需要重点注意的是 -t 参数，这里需要明确指定fastq具体的质量值体系（ 详见第2节 ）。sickle能够处理所有三种不同的质量值体系: solexa Phred64，illumina Phred64 和 Phred33 ，这里的sanger指的就是phred33，我认为这个叫法和SOAPnuke的质量值体系命名是一样的原因！
最后是seqtk，修剪低质量碱基的功能模块是 trimfq，默认情况下只需直接给定一个fastq输入文件就行了，结果会直接输出到屏幕，这里我们将其重定向到一份新的输出文件中：
$ seqtk trimfq raw_data/untreated.fq > u.trimfq.fqseqtk trimfq的功能比较单一，只能处理phred33，其他的都不行，参数很简洁。
【注意】 sickle和seqtk trimfq都不能用于adapter序列的切除，它们没有这个功能。
Trimmomatic最优，sickle次之，seqtk第三。当然，这其中结果最好的Trimmomatic丢弃掉的数据要比其他的略多（约1%~2%）。这三种里面比较特殊的是seqtk，它不丢弃任何read，只是将其截短，而且如果长度低于设定的最低read长度就不切除了，直接保留原数据。这也是为什么它相比于Trimmomatic和sickle而言质量要差的重要原因，可即便如此它们的结果其实相差并不多。反观SOAPnuke，不得不说SOAPnuke的过滤效果是最差的，几乎没什么效果。
如果需要同时去除测序接头序列，那么建议使用Trimmomatic；如果只需过滤低质量碱基或者低质量read，可以选择Trimmomatic或sickle，有时sickle会更快一些，如果不愿意read被过滤掉而且质量值体系是phred33，那么可以选择seqtk。