实验设计
作者选取11年的中甜的橙子，从地中选取3棵健康的树以及3棵发病的树。所有土壤收集步骤都必须在冰上进行，挖取根系2cm左右的土壤，晃动根系去掉根表松弛的土壤。然后用画笔刷刷根系以获取根围土壤；然后把所有根系置于提前冰镇的PBS溶液中，根围土壤提取的方法用Edward(2015)的超声提取法。根系要进行两次20S的超声，然后去除根系，4度，12000xg 离心1min获取沉淀。所有根表和根围的 土壤样品都在LifeGuard soil preservation solution (Mobio Laboratories) 中重悬。每个样品处理时间要小于5分钟。从每颗树的四周取土壤样品然后混成一份土壤样品。所有提取的土壤样品用干冰进行运输回实验室，保存于-80度冰箱中。从每份样品中取2g土壤同时用于DNA和RNA的提取，就是同一份土壤样品用不同的DNA或者RNA 用各自的洗脱液洗脱下来。最后分别测序获得10G和8G的DNA和RNA数据量。
生信分析：
Sickle: trimming； 用bowtie去除宿主序列； Megahit: de novo assembly; CD-HIT-est: unigenes; DIAMOND: taxonomic annotation; MEGAN LCA: taxonomy annotation assigned; SOAP; DESeq2; VEGAN: taxonomy and function dissimilarity; VPA variation partitioning analysis : KEGG; MicrobeCensus: average genome size (AGS).
生防菌分离与验证：
细菌的分离培养以及鉴定，作者选取了抗黄龙病效果最好的Burkholderia strains . Two representative Burkholderia strains, namely, Burkholderia metallica (strain A53) and Burkholderia territori (strain A63) 用电转的方法将gfp 质粒转到这两种菌中去。通过荧光和qPCR找到阳性克隆。将这两种菌的15 mL of 1 × 108 cfu/mL 悬液浇到1年的Valencia 甜脐橙品种的幼苗上。控制温度在28-35度，湿度80%。分别在1小时，2天，5天和9天分别提取根围和根表土壤并用PowerSoil DNA Isolation Kit进行DNA提取。检测荧光的引物GFP gene (GFPF 5′-TCCATGC CATGTGTAATCCC-3′, GFPR 5′-CCATTACCTGTC CACACAATCT-3′) was used for the detection of the inoculated strains 用来检测菌的多少。
此外作者选取了2年的Duncan葡萄树，每个做三棵树的重复，每次取1克土壤50 μg/ml kanamycin (strain native resistance for both strains)，这些CFU 鉴定的日期分别在0, 46, 60, 72, 91, 110, 131, 150 以及224天。用15 mL of acibenzolar-S-methyl (ASM) (active ingredient in Actigard 50WG) at 0.33 mg/ml 作为阳性对照。
为了确定所选取的菌株是否对三个防御相关的基因表达起作用，我们使用了反转录PCR的方法鉴定了SAM, encoding S-adenosyl-L-methioninesalicylic acid carboxyl methyltransferase; PR1, encoding pathogenesis-related protein 1; and PR2, encoding pathogenesis-related protein 2 这三个基因的表达量。基因表达量的鉴定分别在1,3,5和7天。三个生物学重复是从三株不同的植物分别取叶片样品。RNA用RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 试剂盒提取。
实验材料:
试剂盒：DNA and RNA were extracted from 2 g of each soil sample using a RNA PowerSoil total RNA isolation kit and the RNA PowerSoil DNA Elution Accessory Kit following the manufacturer’s protocol (MO BIO Laboratories, Inc.) 这里所有的DNA和RNA都是从同一份样品中洗脱下来的！！这样RNA可以代表DNA的实时变化。