[실험기술노트] Western Blotting의 실험적 조작 포인트 및 데이터 분석

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1. 샘플 준비

• ① Lysis :
  ◆ 세포 : 배양 상등액을 버리고 멸균 PBS로 1~2회 세척 ( 배지 내 혈청은 단백질이 풍부하므로 세포 표면과 배양 접시에 남아있는 배지를 제거)한 후 세포를 첨가한다 . lysate (80-100ul/ 60mm 접시) 및 protease inhibitors , 쉐이커에서 흔든 후 lyse 하고 , 언제든지 관찰하십시오. 얼음 위에서 lyse하는 것이 가장 좋습니다 (쉐이커에 얼음 상자를 놓고 얼음 상자에 페트리 접시를 넣습니다).
  ◆ Tissue : Tissue block을 적당한 크기로 잘라 멸균 PBS로 1~2회 헹구고 cell lysate와 protease inhibitor를 첨가한 후 high-speed homogenizer로 균질화 (저온균질화: 2ml flat-bottomed EP의 외면) 조직 블록이 있는 튜브 분쇄 얼음으로 채워진 작은 비커 설정) 또는 분쇄를 위한 고처리량 조직 분쇄 장비 (용해물을 미리 냉각하고 분쇄 ​​공정을 여러 섹션으로 분할하여 각 작은 섹션의 분쇄 시간을 단축하고 부서진 틈에 티슈가 들어있는 EP 튜브를 넣고 분쇄된 얼음에 묻혀 다음 짧은 분쇄 공정 전에 몇 분 동안 식힙니다.) 저온에서 크랙하는 것이 가장 좋습니다 .
• ② 잔해물 제거 (세포 또는 조직을 완전히 용해한 후 용해액에 완전히 용해되지 않아 제거해야 하는 일부 세포 잔해물이 있음): 4°C에서 10-20분 동안 12000rpm으로 원심분리하고 상층액을 취합니다. (세포 찌꺼기는 원심분리 후 튜브 바닥으로 가라앉고, 상층액은 추출된 단백질임)
• ③ 단백질 정량 : BCA 방법으로 단백질 농도를 정한 후 분주한다.
• ④ 단백질 변성 : loading buffer를 넣고 끓는 물에 5분간 끓인다. (끓는 수조는 EP 튜브의 캡을 쉽게 세척할 수 있습니다. 오염을 방지하기 위해 금속 수조 또는 PCR 기계를 사용하여 단백질을 변성시킬 수도 있습니다.)
• ⑤ 보관 : 변성 단백질 시료는 -20°C에서 분주하여 보관하고, 장기 보관은 -80°C에서 보관합니다. 또한 lysis가 완료되는 즉시 -80°C에서 동결 할 수 있으며, de-fragmentation, quantification 및 denaturation과 같은 후속 단계를 위해 샘플을 함께 모은 후 샘플을 꺼낼 수 있습니다.
• 권장 시약:
  △ 碧云天，Western 及 IP 细胞裂解液（P0013） 절단
  △ Pierce™ BCA Protein Assay Kit（23227） 단백질 농도 측정 , 96-웰 플레이트 + 마이크로플레이트 리더 사용 권장, 시약 절약(웰당 200ul BCA 작업 솔루션), 수고 및 시간 절약(마이크로플레이트 리더 스캔, 데이터를 엑셀에 붙여넣기, 농도 각 단백질의 데이터를 계산할 수 있으며 첫 번째 계산을 위해 템플릿을 저장할 수 있으며 다음에 템플릿의 데이터를 직접 입력하여 각 튜브의 농도와 부피를 얻을 수 있습니다.
  BCA 표준 음악 제작: (공식 매뉴얼 조작이 더 복잡하니 간단하게 해보자) 키트에 들어있는 BSA standard의 농도는 2ug/ul, standard curve의 기울기는 설정: 7 well을 준비하고 20을 더하고, 19, 18, 17, 16, 15 각 well에 순서대로, 14 ul deionized water, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ul BSA standard를 넣었으므로 얻어진 standard protein point는 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ug (일반적인 Lysate 단백질 추출 범위 커버 가능, 초고농도 단백질은 적용 불가)
  
  △ Sigma，Sample Buffer, Laemmli 2× Concentrate（S3401） 단백질이 변성되어 단백질이 바닥으로 잘 가라앉고 잘 뜨지 않으며 시료가 원활하게 적재된다. 단점: 2배이므로 단백질 농도가 높은 샘플에만 적합합니다 . 일반 단백질 추출만으로도 Biyuntian (국내산)의 loading buffer를 사용할 수 있습니다.

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2. SDS-PAGE 겔 준비 및 전기영동 분리

2.1 접착제 채우기

• ① 유리판 세척 : 유리판의 규격이 다르므로 두께가 다른 PAGE 젤을 준비할 수 있으므로 접착제 제조 에 적합한 유리판을 선택해야 합니다 이온수로 여러 번 헹구고 유리 조각을 유리판에 기대어 놓습니다 철망바구니는 물때가 묻지 않도록 주의하여 자연건조 하세요.
• ② 플라스틱 프레임 조립 : 유리판을 짝지어 (하나는 유리가 직각인 두꺼운 판 , 다른 하나는 매끈한 얇은 판 ) 쌍을 이룬 유리판을 정렬하고 두 유리판의 하단 가장자리를 같은 수준의 접착제 만들기 브래킷이 고정된 다음 고정 프레임에 설치됩니다. 접착제 만들기 브래킷의 조임 (조임), 접착제 만들기 고정 프레임의 클립 에 있는 스프링의 탄성(조임) 및 고정 프레임의 고무 스트립이 깨끗 하고 탄력이 좋은지 여부 에 주의하십시오 . 접착제 접착제를 쏟을 때 누출이 있는지 항상 주의하십시오 .약간의 누출이 있는 경우 위 그림과 같이 홀더에 1ml 피펫 팁을 고정할 수 있습니다. 홀더의 클립을 인위적으로 조일 수 있습니다.. 누수가 심하면 어쩔 수 없고 세트만 다시 조립하면 됩니다. 그래서동시에 여러 조각을 맞추는 것이 가장 좋습니다 . 항상 사용할 수 있는 것이 있습니다.。
• ③ Glue 준비 : Western에서 사용하는 PAGE 젤은 불연속적이며 2층으로 나누어져 있으며 , 상층은 Stacking Gel , 하층은 Separating Gel 이다 . 혼합시 분리젤 하부층을 먼저 혼합 하여500ul의 무수 에탄올 로 접착제를 압착합니다 (수압보다 좋음)., 분리 젤이 굳은 후 무수 에탄올을 붓고 에탄올이 휘발 된 후 이온화 된 물을 부어 잔류 에탄올을 청소 한 다음 라미네이팅 젤의 상층을 일치시킵니다. Stacking gel은 일정한 높이를 가져야 하며, 일반적으로 sample well의 바닥과 분리 gel 사이의 거리는 1~2cm 가 적당하며, 이 거리가 너무 짧으면 압력이 잘 맞지 않고, 거리가 너무 길면 길면 분리 젤이 짧아져 단백질 분리에 영향을 미칩니다.
• ④ Comb 삽입 : Comb의 규격이 다르기 때문에 Glue의 두께와 시료량에 따라 적합하므로 주의가 필요합니다. 층상 접착제를 부은 직후에 빗을 삽입 하고 동작이 빨라야 합니다. 그렇지 않으면 샘플 구멍이 쉽게 변형됩니다. 빗을 꽂을 때 굳지 않은 아크릴아마이드는 유독하기 때문에 두꺼운 짚으로 막는 것이 가장 좋으며 빗을 꽂을 때 얼굴에 분사되기 쉬우므로 보호에 주의 하십시오 . 겔로 완전히 중합된 폴리아크릴아미드가 훨씬 더 안전합니다. 따라서 남은 접착제를 버릴 때 완전히 굳을 때까지 기다렸다가 버릴 수 있습니다 . 때때로 빗이 뽑혀 있고 샘플 구멍 사이의 공간이 불안정할 때 빗을 삽입하는 동작이 느려야 합니다.
• ⑤ 빗살 빼기 : 라미네이팅 젤이 굳은 후 무리하게 빗살을 빼지 말고 유리판-글루-빗 세트를 통째로 꺼내 전기영 동조에 넣고 전기영동액을 부어준 후 전기 영동 용액에는 SDS 가 포함되어 있으므로 빗을 뽑을 때 더 부드럽습니다.
• SDS-PAGE 접착제 공식:
  △ 표의 마지막은 일반적인 계산 공식X% 이며 ddH ₂ O의 양을 30% 아크릴아미드의 양으로 조정합니다 . △ 10% AP 와 TEMED 는 아크릴아마이드의 중합반응을 촉매하는 촉매제 없으므로TEMED는 4℃에서 장기간 보관이 가능하여
  
  

2.2 전기영동 분리

• 원리 : 시료는 ⁵ % 스태킹 젤에서 가는 선으로 압축되며 , 이는 버퍼에 있는 글리 시네이트 이온 Gly- ^및 Cl- 의 영향입니다 . 스태킹 겔 에서 Cl- ^가 앞쪽으로 흐르고 중간에 단백질 샘플이 흐르고 끝에 Gly- ^염 이온이 흐르고 Gly- ^와 Cl- 사이에 ^전압 구배가 형성되어 단백질 샘플을 압축한다. 분리 젤 , Gly ^- , Cl - 단백질 앞에 달리면 단백질 시료가 전압 구배의 한계를 벗어나 단백질의 크기에 따라 다른 속도로 유영하기 시작하여 크기에 따라 분리한다 ^. 단백질.
  
• 적층 겔 농도 : 약 5%, pH 6.8.
• 분리 젤 농도 : 7.5-15%, pH 8.8. 분리 젤의 농도가 다르면 단백질 샘플에 대한 분리 능력이 다릅니다. 농도가 낮을수록 분리가 잘 되지만 작은 단백질은 쉽게 빠져나와 10-12%가 일반적으로 사용됩니다.
• 전기영동 시 주의사항
  ① SDS-PAGE는 이온에 민감하므로 탈이온수를 사용하여 전기영동액을 준비하고 전기영동 탱크와 전기영동액이 담긴 용기도 탈 이온수 .
  ② 샘플을 로딩하기 전에 인슐린 바늘 로 샘플 구멍을 플러싱합니다 .
  ③ 전기영동액은 하루 전에 미리 준비하여 잘 섞어 4℃에 두고 사용할 때 전기영동조를 약간 기울이고 전기영동액을 수조 내벽을 따라 천천히 붓는다. PAGE 젤의 하단 가장자리에 기포가 없는지 확인할 수 있습니다 . (SDS는 전기영동용액에 포함되어 있습니다. 바로 만들어서 사용하면 SDS에서 생성된 거품이 PAGE 젤 바닥에 쌓이는 등 전기영동에 영향을 미쳐 레인마다 차이가 납니다.) ④ 단백질을 천천히 첨가합니다. 단백질이 없는 well
  도 같은 부피 에 loading buffer를 첨가하여 나오는 단백질 밴드가 더 균일하게 나오도록 합니다 . 단백질 밴드 는 작거나 비어 있는 웰로 떠오를 것입니다. . 웰에 미리 염색된 단백질 마커를 놓는 것을 잊지 마십시오 .

• 추천시약 :
  △ 天能(국내 고급품), SDS-PAGE 겔화 브라켓, 겔화 고정틀, 빗, 유리판
  △ 겔의 모액 및 전기영동액 준비를 원하지 않는 경우, 권장 迪生(제품 품질이 안정적임) SDS-PAGE stocking buffer및 TGS buffer.
  △ 미리 염색된 단백질 마커를 Thermo Scientific사용할 수 있습니다 PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa（26619）.

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3. 전사 필름

• 습식 전사 와 반건식 전사 두 종류가 있습니다 .
  습식 전사 : 다량의 전사액에 모두 담근다. 샌드위치는 스폰지 패드, 여과지, 접착제 , PVDF 멤브레인 , 여과지, 스폰지 패드와 같이 음극 에서 양극으로 전사 필름 탱크에 수직으로 삽입됩니다 . 반건조 이송 : 소량의 이송용액으로 샌드위치를 ​​촉촉하게 유지시켜줍니다. 반건식 이송기구는 수평형으로 음극이 위, 양극이 아래에 있고 스펀지 패드가 없고 여과지가 전극판에 직접 부착되어 있다 양극에서 음극으로 , 순서 는 양극 금속판, 여과지, PVDF 막, 접착제, 여과지, 음극 금속판, 플라스틱 캡입니다.
  

• 습식 이송 및 반건식 이송을 위한 샌드위치 제조 및 이송 솔루션 공식 :
  

• 추천하다:GE，PVDF 膜（A10074129）

• 멤브레인 이송 시 참고 사항: ① NC 멤브레인 결합 단백질의 효율은 약 80-100ug/cm ² 인 반면 PVDF 멤브레인은 155-300 ug/cm에 달할 수 있으므로 PVDF 멤브레인
  (높은 단백질 결합 효율) 을 사용하는 것이 좋습니다. ² . ② 막을 옮길 때 2개의 판을 준비하여 큰 판 에는 전사액을 , 작은 판에는 적당량 의 메탄올을 붓는다. 유리판에서 접착제를 떼어내고 라미네이팅된 접착제 부분을전사액에 담근 후 접착제와 같은 크기의 여과지 도 전사액에 담가둔다 . 절단된 PVDF 멤브레인을 메탄올에 담그려고 서두르지 말고 10초 동안 메탄올 액체 표면에 부드럽게 떠 있게 하십시오.이 10초 동안 메탄올은 PVDF 멤브레인을 활성화하기 에 충분하며, PVDF 멤브레인. 마지막에 죽일 수 없으므로 먼저 샌드위치 만들기를 시작할 수 있습니다.
  PVDF 멤브레인을 추가할 때 멤브레인을 메탄올에 던져 활성화합니다., 활성화되는 즉시 샌드위치에 즉시 로드됩니다.
  ③ 샌드위치를 ​​만들 때는 유리 압연 막대를 사용하거나 깨끗하고 매끄러운 유리 시험관을 사용하여 멤브레인과 접착제 사이의 기포를 갈아서 제거 해야 합니다 .
  ④ 습식 전사 조건은 일반적으로 오후 10시에 설정되며 200mA 恒流，2.5-3h시간이 비교적 길고 열 발생 이 필름 전사 효과에 영향을 미치기 때문에 열 발생을 제어해야 합니다 . 으깬 얼음을 채운 큰 아이스박스를 준비하고 약간의 물을 추가한 다음 전사용 필름 탱크를 얼음물 혼합물 에 묻어 식히는 것이 가장 좋습니다. 아이스박스와 전사필름탱크를 자석에 넣어 교반기에 넣고 다시 저어주거나, 전사탱크를 4°C 냉동고 에 직접 넣어 식힙니다 .
  Bole 의 전사 필름 탱크는 매우 뜨겁고 제어가 필요하지만 Pharmacia 의 전사 필름 탱크는 더 나은 열 제어가 가능하며 열을 전혀 얻을 수 없습니다.
  ⑤ 반건조 샌드위치는 촉촉하게 유지하되 샌드위치 주변의 금속판은 건조하게 유지해야 한다 .
  ⑥ 세미드라이 이송의 조건은 를 사용하는 것이다 恒压 20V，20min-1h. 단백질이 크면 전송 시간을 연장할 수 있습니다.
  ⑦ Wet Transfer는 다양한 크기의 단백질을 이송할 수 있으며 일반적인 semi-dry transfer는 30-120KD 크기의 단백질을 이송하는 데 적합합니다. 이것은 특정 기계에 따라 다릅니다.
  ⑧ 이동 용액 에는 탈이온수도 필요하다.준비를 위해 이송 탱크와 용기를 탈이온수로 세척해야 합니다.단백질 크기에 따라 transfer solution 공식 조절 필요, 큰 단백질 ( >100 kD): SDS 1g, 메탄올 0ml, 작은 단백질 ( <100kD): SDS 0g, 메탄올 200ml.
  ⑨ 막전이 과정에서 SDS와 메탄올의 효과는 정반대이다.
  · SDS가 단백질과 결합 된 후 젤에서 단백질을 더 쉽게 이동할 수 있지만 단백질이 멤브레인에 결합하는 것 , 특히 단백질이 NC 멤브레인에 결합하는 것을 방지 할 수도 있습니다 . 따라서 큰 단백질은 쉽게 전이가 되지 않아 추가로 SDS를 첨가해야 하며, 작은 단백질은 PAGE 젤에서 SDS로 전이될 수 있습니다. 과도한 SDS는 또한 전류에 영향을 미치고 열을 증가시켜 일부 단백질의 항원성에 영향을 미칩니다. 따라서 상황에 따라 SDS의 내용을 통제할 필요가 있습니다.
  · 메탄올은 SDS와 단백질의 결합을 파괴하고 단백질과 막의 결합을 촉진할 수 있지만 PAGE 겔의 기공 크기를 줄이고 일부 단백질을 침전시켜 실험 결과에 영향을 미치므로 양을 엄격히 조절해야 한다 .

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4. 항체 혼성화

• 1> 블로킹 : 블로킹 용액 으로 5%脱脂牛奶또는 5% BSA( 용해) 사용 , 블로킹 조건 : . (표적 단백질이 막으로 전달된 후 막에 다른 많은 단백질이 있기 때문에 총 단백질이 젤을 실행하는 데 사용되기 때문에 다른 비표적 단백질도 막으로 전달되어 많은 항체가 노출됩니다. 따라서 항체 혼성화 전에 막이 차단되어야 합니다.) ◆ BSA : 우유에는 단백질 인산화 변형 상태를 변화시키는 포스파타아제가 풍부하기 때문에 일반적으로 단백질 인산화 변형 검출에 사용됩니다. ◆ 때로는 차단 용액 공식 및 차단 조건도 변경해야 하며, 특히 큰 단백질의 경우 5% 탈지유로는 1시간 동안 차단하기에 충분하지 않습니다. 일부 단백질은 우유 및 BSA와 함께 사용하지 않을 수 있습니다. 항체를 차단하거나 차단하지 않고 직접 적용합니다.TBST室温 1h，或 4℃过夜
  
  

• 2> 1차 항체 인큐베이션 : 1차 항체를 차단 용액으로 4°C에서 밤새 희석하거나 실온 또는 37°C에서 1-X h 동안 희석합니다.

• 3> 멤브레인을 TBST , 실온, 5분 x 4회 세척합니다.

• 4> 2차 항체 인큐베이션 : 실온에서 1시간.

• 5> 멤브레인을 TBST , 실온, 5분 × 8-12회 세척합니다.

• 6> ECL 발색 , X선 필름 압착 또는 필름 스캐닝.

• TBS 공식 : 그냥
  1L TBS추가하세요 . : 항체의 특이적 인식능력을 향상시킬 수 있는 재폴딩 항원의 기능을 가진 비이온성 세정제로서 차단효과를 향상시키고 불활성 단백질이나 비이온성 세정제로 멤브레인의 비결합 부위를 차단하여 항체 비특이적 결합으로 단백질을 유화할 때 단백질 구조를 파괴하지 않는다.1ml Tween 20TBST
Tween 20
  

• 권장 시약 :
  Dickson , TBS. (파우더 1포에 500mL 함유)
  GE , Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Regent(RPN2232)는 효과는 있으나 고가이며, Biyuntian은 가성비가 더 높다.
  Thermo, SuperSignal West Pico 화학발광 기판(34080).

5. 이미지 분석

• Gel-Pro Analyzer 또는 ImageJ 사용 (권장)
• 참고:
  임상의를 위한 기초 과학 연구 - 13. WB 결과 처리(필독 권장)
  [실험 기술 연구 노트] Western Blot band analysis｜Image J 및 Graphpad band grayscale 분석 및 처리 프로세스
  Western blot 경험 인벤토리, 여기 One article is 전문가 수준의 Gel-Pro로 전기 영동 사진을 측정하기에 충분합니다 .
  

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6. 일반적인 문제 분석

1) 비특이적 밴드:

• 항체 농도가 너무 높음: ◆ 항체 농도 감소
• 불충분한 차단:
  ◆ 차단 용액 농도 증가(예: 5%에서 7%)
  ◆ 차단 시간 및/또는 온도 증가
  ◆ 차단 완충액에 0.05% Tween 20 첨가
  ◆ 항체 희석에 동일한 차단 용액 사용
• SDS는 항체와 단백질 밴드의 비특이적 결합을 일으킵니다.
  ◆ 이동 후 얼룩을 씻으십시오.
  ◆ 면역 분석 중에 SDS를 사용하지 마십시오.
• 항체 품질: 다른 항체 시도

2) 밴딩이 약하거나 없음

• 
  항체 문제, 낮은 활성 또는 낮은 농도, 낮은 친화도 1차 항체, 1차 및 2차 항체 불일치
  : ◆
  항체 농도를 높입니다. -2차 조합
• 불충분한 항원-항체 반응성:
  ◆ 젤에서 샘플당 총 단백질 부하를 증가시킵니다.
  ◆ 단백질이 분해되지 않도록 샘플 무결성을 확인합니다.
• 차단액으로 항원 차단
  ◆ 다른 차단액 사용(예: 인산화 단백질 검출 시 우유 피하기)
  ◆ 차단액 농도 최적화, 3~5% BSA 또는 무지방 분유 권장
• 화학 발광 기질의 성능 저하
  ◆ 기질 배양 시간을 늘립니다
  . ◆ 소량의 작동 용액을 준비하여 기질이 활성을 잃었는지 확인합니다. 어두운 방에서 소량의 HPR 접합체를 기판 작동 용액에 추가하면 청색광이 나타나야 합니다. 그렇지 않은 경우 기질 또는 HRP 접합체는 비활성이어야 합니다.
  ◆ 기질 키트의 두 병 사이에 교차 오염이 없는지 확인하십시오. 두 시약 사이에 교차 오염이 발생하면 시약의 활성이 감소합니다.
  ◆ Azide는 HRP의 억제제이므로 2차 항체 버퍼에 azide를 사용하지 마십시오.
• 블롯에서 항체 제거 및 재혼성화
  항체 제거 조건 최적화
  필요한 경우에만 재혼성화 검출 수행
  동일한 블롯의 반복 재혼성화 방지
• 불충분한 전사
  ◆ 전사 시간이 너무 짧음 습식 전사를 사용하는 경우 전사 시간을 늘려야 함
  ◆ 전사 전계가 너무 약함 전사 전압 또는 전류를 높임
  ◆ 전사 솔루션이 최적화되지 않음 추가 0.01~0.05% SDS
  ◆ Transfer buffer의 메탄올 농도를 5% 이하로 낮춥니다.
  ◆ 겔 선택이 적절하지 않은 경우 폴리아크릴아마이드 겔의 비율을 낮추어 사용
  ◆ 멤브레인 염색은 ponceau red 염색액, transfer 후 gel 염색은 Coomassie bright blue 염색액을 사용하여 transfer 효율을 확인하고 이를 바탕으로 transfer 최적화 멤브레인 상태.
• 이송
  ◆ 이송 시간이 너무 길면 시간을 줄이십시오.
  ◆ 이송 전기장이 너무 강하면 이송 전압 또는 전류를 줄
  입니다. ◆ 이송 용액이 최적화되지 않았습니다. 저분자량 ​​단백질의 과도한 전달을 방지하기 위해 겔에 SDS를 집중적으로 주입합니다.
  ◆ 이동 완충액의 메탄올 농도를 40%로 높입니다.
  ◆ 부적절한 겔 선택, 더 높은 비율의 아크릴아미드 겔 사용
  ◆ 표적 단백질 분자량이 10 KD 미만인 경우 트리스/트리신 겔을 사용하십시오. 0.2 μm 멤브레인을 사용하여 작은 단백질의 과잉 전달을 해결합니다.
  ◆ 작은 단백질은 큰 기공의 블로팅 막을 통과하게 되며, 0.45μm 멤브레인 위에 0.2μm 멤브레인을 겹쳐서 작은 단백질의 과도한 이동을 감지합니다.

3) 신호가 과포화됨

• 속이 빈 밴드:
  ◆ 로딩 부피가 너무 높음, 샘플당 총 단백질 로딩 감소
  ◆ 항체가 너무 많음, 1차 항체 및/또는 2차 항체 농도 감소
  ◆ 화학 발광 기질이 너무 민감하여 덜 민감한 화학 물질로 대체 발광 기질
• 밴드가 너무 조밀하여 밴드가 서로 달라붙습니다.
  ◆ 너무 많은 샘플을 로드하면 샘플당 총 단백질 로드가 감소합니다.
  ◆ 너무 많은 항체가 있으면 1차 및/또는 2차 항체 농도가 감소합니다.

4) 스트립의 기포:

• 부적절한 샌드위치 조립
  ◆ "샌드위치" 조립 시 더 많은 이동 버퍼 사용
  ◆ "샌드위치" 조립 시 겔과 멤브레인 사이의 모든 기포를 제거하십시오.
  ◆ 항체 배양 전에 Ponceau를 사용하십시오. 멤브레인을 염료 용액으로 염색하여 품질을 확인하십시오. 전사막.

5) 불균일한 필름 이송:

• 얼룩의 부분 건조 또는 불균일한 수화
  전체 얼룩이 고르게 잠기고 이동 완충액에 평형화되었는지 확인하십시오
  .
• 하드웨어 문제
  ◆ 습식 전사 장치의 배선 연결을 확인하십시오.
  ◆ 금속판이 깨끗하고 물리적 손상이 없는지 확인하십시오. 금속판이 약간만 구부러져도 세미 드라이 전사 시스템의 전계 강도가 크게 바뀔 수 있습니다. ◆
  사용 좋은 품질 필름 장비의 균일한 전계에는 기술적인 내용이 있으므로 필름 전사 장비를 구입하는 비용을 절약할 수 없습니다)

6) 배경이 너무 강함:

• 1차 및/또는 2차 항체 농도가 너무 높음: 1차 및/또는 2차 항체 농도를 희석하십시오.
• 불충분한 차단
  ◆ 차단 완충액 농도 증가(예: 3~5% 소 혈청 알부민, 카제인, 탈지유)
  ◆ 차단 시간 및/또는 온도 감소
  ◆ 차단 완충액에 0.05% Tween-20 추가
  ◆ 동일한 항체 희석제 사용 차단 용액(0.05% 추가 트윈-20)
• 잘못된 차단 용액 사용, 차단 완충액에서 단백질에 결합된 1차 및/또는 2차 항체: 다른 차단 용액(알부민, 카제인, 탈지유 등)을 사용해 보십시오. 아비딘-비오틴 시스템을 사용할 때 블롯을 차단하기 위해 우유를 사용하지 마십시오. 우유에는 비오틴이 포함되어 있습니다.
• 불충분한 세척
  ◆ 세척 횟수 및 완충액 용량 증가(최소 5 × 5분)
  ◆ 세척 완충액이 포함되지 않은 경우
• 노출 시간이 너무 깁니다. 이미징 노출 시간을 줄입니다.
• 얼룩이 블로팅 중에 건조됩니다.
  얼룩이 젖은 상태로 유지되는지 확인하십시오.
  얼룩이 마르지 않도록 충분한 액체로 덮여 있는지 확인하십시오.
• 버퍼 재사용으로 오염 발생: 새 버퍼 사용

7) 배경이 번짐

• 얼룩의 일부가 건조됨
  얼룩이 젖은 상태로 유지되는지 확인
  얼룩이 마르지 않도록 충분한 액체로 덮여 있는지 확인
• 일부 얼룩 영역과의 세척 버퍼 접촉이 불충분합니다.
  세척 버퍼 양을 늘립니다
  . 하나의 배양 용기에 너무 많은 얼룩이 쌓이지 않도록 합니다.
• 일부 얼룩 영역과 세척 버퍼의 불충분한 접촉: 깨끗하거나 새로운 전송 "샌드위치"를 사용하십시오.
• 얼룩의 오염
  ◆ 얼룩을 손으로 직접 만지지 마십시오. 항상 청소용 장갑을 착용하거나 의료용 핀셋을 사용하십시오.
  전기영동 장비, 이송 장비 및 배양 플레이트가 깨끗하고 외부 오염원으로부터 떨어져 있는지 확인하십시오.

8) 배경이 얼룩덜룩하다

• 겔 조각이 블로팅 멤브레인에 부착: 블로팅 멤브레인 표면에 남아있는 아크릴아미드 겔 조각을 제거합니다.
• 덩어리진 차단제가 얼룩에 달라붙음
  ◆ 차단제가 완전히 녹은 후 사용하세요.
  ◆ 차단 완충용액에 0.1% Tween-20을 첨가하세요.
• 항체 응집
  ◆ 0.2μm 필터를 사용하여 항체 버퍼 용액을 필터링합니다.
  ◆ 신선한 항체를 사용합니다.
  ◆ 항체 버퍼 용액에 0.1% Tween-20을 추가합니다.
• 버퍼 오염
  ◆ 새 버퍼 사용
  ◆ 0.2μm 필터가 있는 필터 버퍼

9) 내부 참조 단백질의 함량이 다른 샘플 간에 일치하지 않습니다.

• 실험 중 내부 참조로 선정된 하우스키핑 단백질의 발현량은 변화하는데
  , 선택된 내부 참조 단백질이 실험 조건에서 일관성을 확인하고 검증하여 현재의 실험 조건이 내부 참조 단백질의 발현 수준을 바꾸지 않을 것임을 의미합니다. reference protein을 주기 위해 dye를 사용하여
  멤브레인의 total protein을 염색하였고, membrane에서 검출된 total protein을 internal reference로 사용하였다.

10) 내부 참조 단백질 검출 신호 포화도

• 실험 중 내부 대조군으로 선정된 하우스키핑 단백질의 발현량 변화
  샘플 부피를 줄여 신호 포화 제거
  항체 농도를 희석하거나 배양 시간을 줄여 검출 신호 포화 방지
  다른 저농도 단백질 선택 내부 참조로 표현 멤브레인
  의 총 단백질을 염료로 염색하고 멤브레인에서 검출된 총 단백질을 내부 참조로 사용