转录组之序列剪切（Trimmomatic）[学习笔记通俗易懂版]

转录组之序列剪切（Trimmomatic）

本文简介：这篇文章是经过了自己学习实践出来的，参考了很多资料，如若有大佬能指出错误，我将感激不敬，有错误，请在评论区留言，谢谢。 更新日期：2023年7月6号

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在这里我们们先介绍以下为什么需要进行序列剪切；序列剪切（sequence trimming）是在测序数据分析中的一项预处理步骤，其目的是去除低质量的碱基和噪音，以提高数据的质量和准确性。

以下是进行序列剪切的一些常见原因：

1. 去除低质量碱基：测序过程中，每个碱基都有一个关联的质量值，表示该碱基被正确测序的可信度。序列剪切可以去除开头或末尾质量较低的碱基，以提高数据的质量和可靠性。
2. 去除适配器序列：在DNA测序过程中，通常会使用适配器序列将DNA片段连接到测序芯片上。适配器序列可能残留于测序数据中，对后续分析造成干扰。序列剪切可以帮助去除这些适配器序列。
3. 去除重复序列：在某些实验中，可能会出现PCR扩增引起的重复序列，这些重复序列可能影响后续分析的准确性。序列剪切可以帮助去除这些重复性序列。
4. 去除噪音和杂质：测序数据中可能存在噪音、测序错误或其他杂质。序列剪切可以帮助去除这些噪音和杂质，提高数据的准确性和可信度。

通过序列剪切，可以提高测序数据的质量和准确性，减少后续分析的误差，并帮助从原始测序数据中提取出更有意义的信息。

接头的由来

文库构建前，核酸经过随机打断，有的本身就长短不一(mRNA)，因此接头之间片段长度也长短不一，而二代测序的测序长度一般是固定，肯定会有部分短于测序读长的序列被测序，因此测序序列中包含了部分或全部接头序列，需要进行接头序列的检测并过滤掉对应的reads或截掉接头序列。（如下图所示得蓝色接头部分，有些测到了接头（部分与全部都有可能），至于原因建议去看二代测序原理，这里内容过多，不宜展开）

Trimmomatic软件简介

Trimmomatic是一个广受欢迎的 Illumina 平台数据过滤工具。其他平台的数据例如 Iron torrent ，PGM 测序数据可以用 fastx_toolkit 、NGSQC toolkit 来过滤。支持多线程，处理数据速度快，主要用来去除 Illumina 平台的 Fastq 序列中的接头，并根据碱基质量值对 Fastq 进行修剪。软件有两种过滤模式，分别对应 SE 和 PE 测序数据，同时支持 gzip 和 bzip2 压缩文件。

上次我们使用FastQC软件得到质控后的结果，从结果我们可以得到，某数据是否需要切除序列，切除多少，是否有接头，在FastQC过表达部分可以看到有重复序列，重中发现相同的规律也可以使用该序列去掉不想要的部分（这句话当我没说过，因为我没试过）。

Trimmomatic软件的下载（只提供 Linux）

1、Trimmomatic软件的下载。

wget https://github.com/usadellab/Trimmomatic/files/5854859/Trimmomatic-0.39.zip

2、解压

unzip Trimmomatic-0.39.zip

配置环境(我配置在了~/.bashrc文件中 )

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# trimmomatic
echo "export PATH="/home/cyh/biosoft/Trimmomatic-0.39: $PATH" " >> ~/.bashrc

3、测试 (help一下)

java -jar /home/cyh/biosoft/Trimmomatic-0.39/trimmomatic-0.39.jar -h

Trimmomatic软件的使用

官网参考地址：USADELLAB.org - Trimmomatic: A flexible read trimming tool for Illumina NGS data

部分参数简介：

ILLUMINACLIP: Cut adapter and other illumina-specific sequences from the read.
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 # 切除TruSeq3-PE中提供的Illumina适配器，去接头
SLIDINGWINDOW: Perform a sliding window trimming, cutting once the average quality within the window falls below a threshold.
SLIDINGWINDOW:4:15 #扫描4个碱基宽滑动窗口，当每个碱基的平均质量下降到15以下时进行剪切
LEADING: Cut bases off the start of a read, if below a threshold quality
LEADING:3      # 删除前低质量碱基(低于质量3)
TRAILING: Cut bases off the end of a read, if below a threshold quality
TRAILING:3      # 删除后低质量碱基(低于质量3)
CROP: Cut the read to a specified length
CROP：length    #从reads开始开始所要保留的碱基数为length
HEADCROP: Cut the specified number of bases from the start of the read
HEADCROP:12      #删除前12个碱基
MINLEN: Drop the read if it is below a specified length
MINLEN:36      # 上述步骤完成后，删除小于36个碱基的reads （放最后）
TOPHRED33: Convert quality scores to Phred-33
-phred33    #表示将质量分数转换为 Phred-33
TOPHRED64: Convert quality scores to Phred-64
-phred64    #表示将质量分数转换为 Phred-64

“phred33"是一种常见的测序数据格式的表示方式，用于表示DNA测序中的质量值。在该格式中，每个碱基对应一个ASCII字符，表示测序质量的分数。其中，字符”!"表示质量值为0，而字符"I"表示质量值为40。这种表示方式主要用于Sanger测序和Illumina测序等技术中。

单端（例子）：

java -jar trimmomatic-0.35.jar SE -phred33 input.fq.gz output.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

上述例子描述：SE表示单端，使用数据格式为33的；input.fq.gz表示输入文件，output.fq.gz表示输出文件，两个文件格式都为 .fq格式的压缩文件（Trimmomatic可以输入输出压缩文件）；ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE:2:30:10表示软件自带的Illumina适配器，用于去接头；LEADING:3表示前（端）切除质量低于3的碱基；TRAILING:3表示后（端）切除质量低于3的碱基；SLIDINGWINDOW:4:15表示扫描4个碱基宽滑动窗口，当每个碱基的平均质量下降到15以下时进行剪切；MINLEN:36表示删除小于36个碱基的reads（该参数需要在最后使用）

双端：

java -jar trimmomatic-0.35.jar PE -phred33 input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

双端与单端的类似，其中指定PE参数，表示这是双端数据，因为是双端数据，所以输入数据有两个，并且这两个数据必须是配对的（即核酸链的正反两条数据），输出结果有四个，每条reads都会生成两个文件。 "output_forward_paired.fq.gz"表示通过trimmomatic处理后，前向（forward）读取序列中的配对序列（paired sequences）输出到该文件。 “output_forward_unpaired.fq.gz” 表示通过trimmomatic处理后，前向 （forward）读取序列中未配对的序列（unpaired sequences）输出到该文件。"output_reverse_paired.fq.gz"表示通过trimmomatic处理后，后向（forward）读取序列中的配对序列（paired sequences）输出到该文件。 “output_reverse_unpaired.fq.gz” 表示通过trimmomatic处理后，后向 （forward）读取序列中未配对的序列（unpaired sequences）输出到该文件。在指定接头适配器时注意时PE（ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10）

HEADCROP:12 表示删除前12个碱基

注意：如接头文件不在当前目录下，要指定，写全路径，否则报错。

实际举例：

在这里我使用了一对（正反数据）SRR12415652_1.fastq与SRR12415652_2.fastq，这个数据在数据库能下（至于时NCBI还以TCGA因年代久远，搞忘了）

java -jar /home/cyh/biosoft/Trimmomatic-0.39/trimmomatic-0.39.jar PE /home/cyh/Desktop/fastq_dir/SRR12415652_1.fastq /home/cyh/Desktop/fastq_dir/SRR12415652_2.fastq /home/cyh/Desktop/SRR124_result/SRR12415652_1_paired.fq.gz /home/cyh/Desktop/SRR124_result/SRR12415652_1_unpaired.fq.gz /home/cyh/Desktop/SRR124_result/SRR12415652_2_paired.fq.gz /home/cyh/Desktop/SRR124_result/SRR12415652_2_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 HEADCROP:12 MINLEN:36 

跑完数据后，我们需要对生成得结果（只需要paired的）进行质控（FastQC），再一次看一下质控报告。

结果如下：（SRR12415652_1的，2 的差不多，不展示了）

• Per base sequence quality部分

  剪切前后对比

这部分肉眼可见的完美，

• Per base sequence content部分

  剪切前

剪切后

这部分我因为删除了前12个碱基，所以前面就没有了。（这个其实可以不切，看需求吧）

• Adapter Content 部分

  剪切前

剪切后

接头部分，使用肉眼就可以看出，接头别去掉了，这部分很重要，数据中的接头是要去掉的，这样不会影响后面的数据，降低噪音，提高数据质量与准确性。

其他质控部分就不看了。自己可以找个数据跑一跑。

到此，本文内容结束，这篇文章是经过了自己学习实践出来的，参考了很多资料，如若有大佬能指出错误，我将感激